重組蛋白表達實驗中,經(jīng)常會遇到需要表達10kd一下的目的蛋白,常規(guī)的SDS-PAGE若是用來跑小分子蛋白,
會造成模糊不清,膠質(zhì)過軟,甚至跑不出來等情況。
而Tricine膠可以很好的解決10kd以下的小分子蛋白鑒定問題。
Tricine膠比較容易將樣品壓平,跑出來的Marker又細又直。
同樣,顯出來的條帶也壓的很好。
與普通的SDS-PAGE膠跑出來的結(jié)果相比,Marker擴散沒有那么厲害,各泳道條帶間隔明顯,
不像普通膠的條帶容易連到一起。
配方如下:
10×內(nèi)槽電泳液(-極)(Cathode Buffer)1L
Tris-Base 121.1g
Tricine 179.2g
SDS 10g
加水至800ml,用HCl調(diào)整pH至8.25,定容至1L。
本緩沖液是Tricine-SDS-PAGE的內(nèi)槽緩沖液(陰極)。
內(nèi)外槽電泳液的體積置配參考,一般電泳槽內(nèi)槽一次只要200mL液體,而外槽需要400-500mL液體。
傳統(tǒng)實驗手法建議:
制膠時,分離膠做好后加水壓平,一般20min左右凝固。
為了避免樣品漏的問題,可在分離膠凝固后(表現(xiàn)為分層處出現(xiàn)一條清晰的分界線),先不急著把水控干,
而是配置積層膠,先不加APS和TEMED,再空出水(槍頭沿一邊吸盡即可),
再在積層膠里加入APS,TEMED,迅速混勻,先取少量膠液灌入板內(nèi),輕輕搖晃幾下,潤一遍,棄掉這些膠液,
這時候盡量去干凈,動作要快。再正式灌滿膠液,插上梳齒。
跑電泳時,可以60V先壓約30min,可以看到溴酚藍變的又細又直,待進入分離膠,
可以看到預(yù)染的Marker已經(jīng)分離,就可以將電壓調(diào)至120V跑完。
轉(zhuǎn)膜與普通一樣,建議30V恒壓轉(zhuǎn)2小時(用于80KD以下的蛋白分子),如果有更大的蛋白280KD的mTor,
可以2h后再加350mA 30min,效果很好,280KD以下90KD以上的都可以加350mA這一步,時間根據(jù)分子量來定。
90KD加15min即可。