一、未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低：
1、大腸桿菌老化
請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
2、質(zhì)?？截悢?shù)低
由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。
3、菌體中無(wú)質(zhì)粒
有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。
4、堿裂解不充分
使用過(guò)多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液I、II和III的用量。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)，可加倍使用溶液I、II和III，可能有助于增加質(zhì)粒提取量和質(zhì)粒質(zhì)量。
5、溶液使用不當(dāng)
溶液II在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
6、吸附柱過(guò)載
不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB 或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒或宿主菌是非常高的拷貝數(shù)或生長(zhǎng)率，則需調(diào)整LB培養(yǎng)液體積。
7、質(zhì)粒未全部洗脫（尤其質(zhì)粒較大時(shí)）
洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。
8、乙醇?xì)埩?nbsp;
漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。
9、洗脫液加入位置不正確
洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。
10、洗脫液不合適
DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液 (2.5 mM Tris-HCl， pH 8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH7.5-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，導(dǎo)致如果pH過(guò)低可能洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。
11、洗脫體積太小
洗脫體積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
12、洗脫時(shí)間過(guò)短
洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置一分鐘可達(dá)到較好的效果。
二、質(zhì)粒純度不高：
1、混有蛋白
不要使用過(guò)多菌體。溶液I、II和III處理并離心后溶液應(yīng)為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除后再進(jìn)行下一步驟。
2、混有RNA
RNase A處理不徹底，請(qǐng)減少菌體用量或加入溶液III之后室溫放置一段時(shí)間。如果溶液I已保存6個(gè)月以上，請(qǐng)?jiān)谌芤篒中添加RNase A。
3、混有基因組DNA
加入溶液II和III后應(yīng)溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液II后過(guò)于粘稠，無(wú)法溫和混勻，請(qǐng)減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，不要超過(guò)16 小時(shí)。
4、Solution III溶液加入時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
Solution III溶液加入后，放置時(shí)間不要太長(zhǎng)，否則有可能會(huì)產(chǎn)生小片段DNA污染。
5、含大量核酸酶的宿主菌
宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過(guò)程中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和Top10。
6、裂解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
加入溶液II后裂解時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘。菌體量合適時(shí)，裂解應(yīng)該在1分鐘之內(nèi)就可以完成。
7、質(zhì)粒的二聚體、多聚體及復(fù)制中間體形式
質(zhì)粒復(fù)制過(guò)程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測(cè)出。
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