ReScriptTMII Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基礎(chǔ)上通過(guò)分子進(jìn)化技術(shù)多點(diǎn)突變的新一代反轉(zhuǎn)錄酶，大幅度提高了穩(wěn)定性和反轉(zhuǎn)錄效率。RescriptTMII RT SuperMix for qPCR(+gDNA Eraser)適用于兩步法qRT-PCR檢測(cè)。試劑盒中的4×gDNA Eraser Mix可去除RNA模板中殘留的基因組DNA，保證后續(xù)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。5×ReScriptTMII RT SuperMix II中含有反轉(zhuǎn)錄第一鏈合成所需的所有組分（Buffer，dNTP Mixture，ReScriptTMII Reverse Transcriptase，RNase Inhibitor，Random 6 mers/Oligo (dT)Primer Mix），加入模板RNA和水即可迅速進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)終止gDNA Eraser作用，保證cDNA的完整性。
本試劑盒針對(duì)qPCR進(jìn)行Random 6 mers/Oligo (dT)Primer的比例優(yōu)化，使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域起始，并具有相同的反轉(zhuǎn)錄效率，最大程度保證了qPCR結(jié)果的真實(shí)性和可重復(fù)性。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物兼容SYBR Green和探針?lè)?/span>qPCR，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇相應(yīng)的試劑配合使用，進(jìn)行高性能的基因表達(dá)分析。
注意事項(xiàng)
1. 高質(zhì)量的完整的RNA對(duì)于獲得高質(zhì)量的cDNA是至關(guān)重要的。實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)用電泳驗(yàn)證RNA的完整性。
2. 建議RNA是溶于水而不是TE中，因?yàn)?/span>TE中的EDTA會(huì)對(duì)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生抑制。
3. 20 µl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，建議Total RNA加入不超過(guò)2 μg，mRNA不超過(guò)200 ng，否則加入RNA量過(guò)高，可能會(huì)超出后續(xù)qPCR的線性范圍。
4. 4×gDNA Eraser Mix、5×ReScriptTMII RT SuperMix II和5×No RTase Control Mix含有高濃度的甘油，粘度高，在使用前請(qǐng)短暫離心收集到離心管底部，并用移液槍輕輕吸打充分混勻后，準(zhǔn)確吸取，并且不要使Tip插入液面過(guò)深，否則會(huì)因Tip壁粘著造成損失。
5. 可以不經(jīng)過(guò)基因組去除步驟，直接用5×ReScriptTMII RT SuperMix II進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，這樣所得到的結(jié)果會(huì)與使用ReScriptTMII RT SuperMix for qPCR相當(dāng)。但是請(qǐng)勿將gDNA Eraser與其他試劑盒中的5×ReScriptTMII RT SuperMix配套使用，因其不含終止gDNA Eraser反應(yīng)的成分，會(huì)影響反轉(zhuǎn)錄和后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)。
6. cDNA產(chǎn)物僅適用于qPCR反應(yīng)，如果下游實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基因克隆等長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增，可使用RescriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行操作。
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