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一、實驗介紹

早期的shRNA載體多採用RNA聚合酶III型啟動子介導(dǎo)shRNA的表達(dá)，RNA聚合酶III型啟動子如鼠源的U6啟動子和人源的H1啟動子可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)小分子RNA，隨著miRNA干擾機(jī)制的深入研究，發(fā)展出第二代siRNA載體，即採用RNA聚合酶II型啟動子CMW表達(dá)含測翼序列的miRNA模擬物，該載體模擬miRNA的加工，表達(dá)出來的shRNA進(jìn)入RISC沉默複合物的效率要比RNA聚合酶III型啟動子表達(dá)的shRNA高十倍，抑制效率更好，且可以和EGP協(xié)調(diào)表達(dá)，方便觀察轉(zhuǎn)染效率

二、實驗週期

30-35工作日

三、交付標(biāo)準(zhǔn)

 >10ug shRNA載體，已確認(rèn)shRNA目標(biāo)基因轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株，實驗報告，根據(jù)實驗要求，選擇蛋白質(zhì)檢測或分子生物學(xué)檢測

四、客戶提供

目的基因NCBI登陸號

 五、實驗流程

設(shè)計干擾靶點                                  

構(gòu)建干擾載體         培養(yǎng)293T細(xì)胞       靶基因表達(dá)豐度檢測    

豐度高-內(nèi)源篩選     干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞       QPCR檢測干擾效果

豐度低-外源篩選     靶基因真核表達(dá)載體構(gòu)建     干擾質(zhì)粒與表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞     QPCR檢測干擾效果